汪辉教授：准分子激光切削脉络膜制备视网膜神经上皮和色素上皮联合植片

·论著·

准分子激光切削脉络膜制备视网膜神经上皮和色素上皮联合植片

陈少军阴正勤李世迎汪辉任茜罗启惠

摘要

目的　应用准分子激光微切削脉络膜获得视网膜神经上皮及色素上皮联合移植片。

方法　将PN 1-6广西巴马猪眼球冰浴下祛除巩膜、前节和玻璃体,环钻制成视网膜神经上皮-色素上皮-脉络膜复合体。将复合体脉络膜面向上平铺于直径7mm圆形明胶片上,置于无菌培养皿中。采用准分子激光鹰视酷眼系统,准分子激光角膜原位磨镶术(laserinsitukeratomileusis,LASIK)和光治疗性角膜切削术(phototherapeutickeratectomy,PTK)模式发射,切削区域直径为6.5mm。LASIK模式矫正范围- 2.64～ - 4.44D;PTK模式切削深度45～ 75μm。将切削后的标本浸泡于4%多聚甲醛中固定2～ 3d,石蜡包埋、切片、HE染色。

结果　使用LASIK模式矫正- 4.44D相当于PTK模式切削深度67μm,可见被切削的脉络膜边缘到达RPE基底膜;而使用LASIK模式矫正- 3.00D或PTK模式切削45μm时,都仅能祛除脉络膜主体。在判断切削终点上,PTK模式较LASIK模式容易。

结论　准分子激光切削脉络膜可获得较好的视网膜神经上皮和色素上皮联合移植片,避免了用酶消化对视网膜神经上皮的破坏。LASIK和PTK模式都可以到达所需切削的脉络膜深度,但PTK模式更适合这种取材方法。切削深度的变化应当考虑固定方法、组织的含水量及个体间脉络膜厚度的变化等因素。

关键词　激光;　脉络膜微切削;　视网膜神经上皮-色素上皮联合移植片

中图分类号:　R 312;R 773.4　　　文献标识码:　A　　　文章编号:　 1003- 9430(2005)06- 0341- 05

　作者单位:　第三军医大学西南医院眼科(重庆市,400038)

　作者简介:　陈少军(1964～　),女,山西太原人,副教授、副主任医师,主要从事玻璃体-视网膜疾病的研究及视网膜移植实验研究。

ComparisonofMicroablationofChoroidalTissuebyLASIK andPTK Mode forNeuroretina-RPE CograftSheets CHEN Shao-jun,YIN Zheng-qin,LiShi-ying,WANG Hui,REN Qian,LUO Qi-hui DepartmentofOphthalmology,SouthwestHospital,theThirdMilitaryMedicalUniversity,Chongqing 400038,China ABSTRACT

Objective Toobtainneuroretina-RPEcograftsheetsusingexcimerlaserformicroablationofchoroidaltissue.

Methods　Eyesfrom normalGuangxiBamapigspostnataldays 1-6(PN 1-6)wereremovedthesclera,theanteriorsegmentandthevitre-

ous,andseveral5-7mm trephinedspecimenswereobtainedfrom peripheralneuroretina-RPE-choroidcomplexundericebath.Toflatmount

specimensonVibratomeas 150μm sheetsof 50%gelatinwiththechoroidalsidefacingup,andablatea 6.5mm areabyusingLASIKand

PTK modeofexcimerlaser.TheLASIK modecorrectedfrom - 2.64D to - 4.44D;PTK modeablateddepthfrom 45μm to 75μm.

·341·

中国激光医学杂志2005年12月第14卷第6期　ChinJLaserMedSurg,December 2005,Vol 14,No.6Specimenswerefixedin 4%paraformaldehyde 2-3days,embeddedinparaffin,seriallysectionedandstainedwithhematoxylin-eosin.

Results　TheLASIK modeablationmightbeviewedtheablatededgenearthebasementmembraneoftheRPEbycorrection - 4.44D,

approximatelybethePTKmodeablationdepth 67μm;butthedepthonlycouldablatethebulkingofchoroidaltissuebytheLASIKmode

correcting - 3.00D orthePTKmodeablating 45μm.ThePTKmodewaseasierthantheLASIKmodeatjudgmenttheablationendpoint.

Conclusions　Touseexcimerlasermayobtainbetterneuroretina-RPEcograftsheetsandavoidenzymaticalmethodsdamagetoneuro-

retina.BothLASIK andPTKmodemayablatechoroidaltissuetotheneeddepth,however,thePTKmodeisfitterforthisdrawingmate-

rialsmethod.Variousfactorsforthevariabilityofablationdepthmaybeconsidered,includingmethodoffixation,watercontentofthe

tissue,interindividualvariabilityinchoroidaldepth.

Keywords　Lasers;　Microablationofchoroidaltissue;　Neuroretina-RPEcograftsheets

　　由于许多视网膜变性疾病涉及感光细胞和视网膜色素上皮(retinalpigmentepithelium,RPE)细胞的共同病变,单纯移植RPE细胞不能挽救死亡的感光细胞,同时单纯移植的感光细胞也会因为缺乏正常RPE细胞的营养作用而不能长期存活。因此,需要视网膜色素上皮层和神经上皮层的联合移植。目前,大多数的文献报道是采用酶消化法松解RPE和脉络膜之间的联系,剥离脉络膜而得到神经视网膜和色素上皮层,但同时发现酶对供体神经视网膜的发育有害[1]。为此,本研究尝试用准分子激光切削祛除脉络膜组织,制备视网膜神经上皮和色素上皮联合移植片。

材料与方法

一、材料

1.实验动物　新生广西巴马猪(PN 1-6d)3只,雌雄不限,体重0.35～ 0.75kg,购于第三军医大学

动物所。

2.主要试剂与器材　Ames液、4%多聚甲醛、明胶(Sigma公司,美国)。准分子激光(鹰视酷眼系统,美国)。蔡氏手术显微镜,振动切片机(Vi-bratomeseries 1000,英国)。 7mm角膜环钻。

二、方法

1.明胶的熬制及明胶片的制备　称取2.5g明胶粉,放入已消毒的小空瓶中,加入5ml无菌生理

盐水,配成50%的浓度。将瓶盖上插1针头后,放入水浴锅中加热煮沸。待明胶颗粒完全溶化后,稍冷却倒入直径7mm的柱状模型中。完全冷却后将明胶脱模,放4℃冰箱中备用,存放时间小于24h。在获取新生猪眼球前,取出柱状明胶,用振动切片机切削成圆形150μm厚的明胶片,浸入Ames液存放在4℃冰箱中待用。

2.供体视网膜神经上皮-RPE-脉络膜的获取　将3%戊巴比妥钠5ml注入新生猪腹腔内,致死后

取出双眼球,用4℃的Ames液漂洗数次。在冰浴环境下剥离巩膜,祛除角膜、晶体及玻璃体。放射状剪4个缺口后,用角膜环钻钻取周边部4个象限的视网膜神经上皮-RPE-脉络膜复合体(每只眼钻取3～4个),脉络膜面向上平铺于明胶片上(见图1),置于冰浴环境的无菌培养皿中待用。

3.视网膜神经上皮-色素上皮联合植片的制备　激光参数:能量密度0.84mJ/cm 2,发射频率400Hz,切削直径6.5mm。切削脉络膜组织的深度依据本实验室测量的新生小猪正常脉络膜平均厚度63.63μm。放置载有脉络膜-RPE-神经视网膜明胶片的培养皿于操作台上,吸净脉络膜表面的残余液体,将瞄准光聚焦于脉络膜前表面正中央,分别利用PTK(photothera- peutickeratectomy)模式和LASIK模式发射激光,至肉眼下切削区域可透见映衬其下为白色背景即可(见图2)。LASIK模式矫正范围- 2.64～- 4.44D;PTK模式切削深度45～ 75μm。

4.联合植片组织病理学检查　将20个激光微切削脉络膜后的复合体,连同明胶片一起浸泡于4%多聚甲醛中固定2～ 3d,石蜡包埋,切片厚5μm(每个复合体切3张),常规HE染色,光镜下观察。

结　　果

使用LASIK模式矫正- 3.00D,理论上等于切削组织40μm厚。标本切削矫正- 3.00D,显示脉络膜主体已被切除,残留薄层脉络膜组织(见图3);标本切削矫正- 4.44D,对应切削深度为67μm,可见被切削的脉络膜边缘已到达RPE基底膜,相邻处残余的少许脉络膜为切削不均匀所致(见图4)。切削过程中,因脉络膜色素消失不均匀,较难判断切削终点。

使用PRK模式切削45μm厚时,大部分脉络膜主体消失,残留少许脉络膜毛细血管组织(见图5);

·342·

中国激光医学杂志2005年12月第14卷第6期　ChinJLaserMedSurg,December 2005,Vol 14,No.6全祛除,组织切削面较均匀(见图6)。切削过程中,脉络膜色素均匀消失,较易判断切削终点。

图1　铺于明胶片上的视网膜-RPE-脉络膜Fig.1　Retina-RPE-choroidonthegelatinsheets

图2　准分子激光切削后的视网膜-RPE片Fig.2　Retina-RPEsheetsofpost-ablationbyexcimerlaser

　　图3　LASIK模式矫正- 3.00D。脉络膜主体已被切除,残留薄层脉络膜　HE× 1 000

　　Fig.3　LASIK modecorrected - 3. 00D.Thereareobviousdebulkingandthinlayersremainsofchoroidaltissue

　HE× 1 000

讨　　论

一、视网膜神经上皮-RPE联合移植片视网膜色素变性(retinitispigmentosa,RP)进展

　　图4　LASIK模式矫正- 4.44D。被切除的脉络膜边缘已达RPE基底膜　HE× 400

　　Fig.4　LASIK modecorrected - 4.44D.Theedgeof ablatedchoroidaltissueisnearthebasementmembraneof theRPE.　HE× 400

　　图5　PTK模式切削45μm厚时,显示大部分脉络膜主体消失(视网膜脱离)　HE× 400

　　Fig.5　Thedepthofablationis 45μm byusingPTK mode.Thebulkingofchoroidaltissuedisappears(retinalde-tachment)　HE × 400

　　图6　PTK模式切削67μm厚时,切削中心脉络膜组织已完全祛除　HE× 400

　　Fig.6　Thedepthofablationis 67μm byusingPTK mode.Thecenterofablationcannotseethechoroidaltis-sue.　HE × 400

·343·

中国激光医学杂志2005年12月第14卷第6期　ChinJLaserMedSurg,December 2005,Vol 14,No.6到晚期时,感光细胞和RPE细胞都出现变性死亡,但内层视网膜神经细胞的功能基本正常,此时如果移植的健康视网膜组织能与宿主形成功能性突触联系[2,3],就有可能替代病变的组织和细胞。在体内,RPE细胞不仅能吞噬感光细胞的外节盘膜,维持外节的正常,还能产生各种神经营养因子,对神经视网膜上皮层发育和感光细胞成熟有重要作用[4];而感光细胞代谢产物可以改变RPE细胞对Bruch膜的粘附力[5]。因此,感光细胞与RPE细胞的相互作用对于维持视网膜的正常功能很重要。目前,多数的视网膜移植研究只涉及RPE细胞或视网膜神经上皮层的移植[6-8],而在RP晚期,单独移植这两种成分都是没有作用的。

要得到附着RPE细胞的胚胎或新生视网膜神经上皮层很困难,此时感光细胞外节还没开始发育或发育不全,在剥离脉络膜RPE层极易从视网膜神经上皮层脱离,机械分离或酶消化法分都不令人满意。随着准分子激光的引进,一些研究者利用这项新技术制取单层视细胞植片[9-11]和用于生化分析研究的纯Bruch膜[12]。于是启发我们用准分子激光微切削脉络膜,而获得视网膜神经上皮层和RPE层。将来用于视网膜变性宿主眼内的联合植片,*好没有或少有脉络膜的成分。其一是因为脉络膜具有丰富的血管组织,携有组织和非组织特异性抗原,可能引起排斥反应;其二是脉络膜成分防碍视网膜代谢物的扩散[13]。

二、激光切削能量和切削深度

由于血管的变化,特别是死亡后血管的排空很难准确测定脉络膜的厚度。其厚度文献报道差别很大,但基本一致的是后部脉络膜较厚,而前部则较薄。目前尚未见有文献报道兔、猪、鼠等动物的正常脉络膜厚度的数据。我们实验室将成年猪的视网膜、脉络膜平均厚度进行了测量,新生小猪为63.63μm,成年猪为64.75μm。参考Holz等[13]在获取纯Bruch膜时微切削脉络膜使用的激光能量,我们对都是周边部取材的标本使用由低到高的能量切削,切削深度从45 ～ 75μm。从两种模式切削的效果来看,切削深度65～ 67μm时,均可切削脉络膜达到满意要求。但在切削脉络膜过程中,PTK模式较LASIK模式容易判断达到理想深度的切削终

点。这是因为PTK模式在激光发射前,就可根据将要切削的深度设定程序,执行过程中不中断,激光扫描均匀,脉络膜的色素逐渐消失,当看见植片下衬垫的白色背景时,提示到达切削终点。使用LASIK模式切削前,由于不可预测需矫正的度数,切削过程中要间断中止程序以观察切削深度,然后继续执行下一个程序。如此,激光扫描不均匀,某些区域已发白,而某些区域色素仍浓,不易判断切削终点。切削深度的控制是此项技术的关键。在激光切削过程中较难精确地把握切削深度,然而脉络膜黑色素的逐渐消失为切削终点提供了线索。切削时残留少许脉络膜组织对以后的视网膜下腔移植影响不大,因葡萄膜的抗原性较低;但若切削过量,容易损伤RPE层,联合植片获取失败。这项技术虽然不能精确地祛除脉络膜成分,但它仍是目前可用的较好

方法,至少可以去掉脉络膜的主体。切削深度的变化还应考虑到各种因素,诸如不同的供体组织、组织的固定方法、组织的含水量、细胞外基质成分及脉络膜厚度个体变化等。获取健康、优质、较纯的视网膜神经上皮和色素上皮联合植片,是视网膜联合移植术成功的一个重要环节。

参　考　文　献

[ 1] SharmaRK.Dissectionandcotransplantationoflargepieces ofRPEandneuralretinaeffectofproteaseK onthedevel- opment[J].ActaOphthalmolScand,2000,78:3-8.

[ 2] HanitzschR,ZeumerC,LichtenbergerT,etal.Impaired functionofbipolarcellsintheRoyalCollegeofSurgeons rat[J].ActaAnat(Basel), 1998,162:119-126.

[ 3] EisenfeldAJ,LaVailMM,LaVailJH.Assessmentofpossi- bletransneuronalchangesintheretinaofratswithinheri-tedretinaldystrophy:cellsize,number,synapses,andax-onaltransportbyretinalganglioncells[J].JCompNeurol,1984,23:22-34.

[ 4] CampochiaroPA.Cytokineproductionbyretinalpigment epithelialcell[J].IntRevCytol,1993,146:75-82.

[ 5] LiZY,PossinDE,Milam AH.Histopathologyofbonespic-gy,1995,102:805-816.

[ 6] GourasP,Flood MT,KjedbyeH.Transplantation ofcul-turedhumanretinalepithelium preventsphotoreceptorde-generationintheRCSrats[J].InvestOphthalmolVisSci,1989,314:695-671.

[ 7] GourasP,LopezR,DuJ.Transplantationofretinalcells[J].NeuroOphthalmol,1990,10:165-176.

[ 8] SeilerMJ,AramantRB,EhingerB.Transplantationofem- bryonicretinatoadultretinainrabbits[J].ExpEyeRes,1991,51:225-228.

·344·

中国激光医学杂志2005年12月第14卷第6期　ChinJLaserMedSurg,December 2005,Vol 14,No.6[ 9] LiangFQ,BassageSD,delCerroC.A new procedurefor obtainingphotoreceptorcellsfortransplantation[J].Invest OphthalmolVisSci,1994,35(Suppl):1532-1536.

[ 10] HuangJC,IshidaM,HershP.Preparationandtransplan-tationofphotoreceptorsheets[J].CurrEyeRes, 1998,

17:573-585.

[ 11]刘世全,王薇,张惠蓉,等.视网膜视细胞的成片移植

[J].眼科研究,2001,19:315-318.

[ 12] SchuttF,HolzFG.Microablationofchoroidaltissuefrom Bruch'smembraneusinga 193nm excimelaser[J].Exp EyeRes,2002,74:155-157.

[ 13] HolzFG,BindewaldA,SchuttF.Intraocularmicroablation ofchoroidaltissuebya 308nm AIDA excimerlaserfor RPE-transplantationinpatientswithage-related macular degeneration[J].BiomedTech(Berl),2003,48:82-85.

(收稿日期:2004-11-09)

·短篇报道·

CO2激光治疗口腔颌面部静脉畸形

吴蜀江

　作者单位:　大连大学附属中山医院口腔科(大连市,116001)

　　我科采用CO2激光治疗口腔颌面部静脉畸形,取得了较好的治疗效果,现报道如下。

资料与方法

1.临床资料口腔颌面部静脉畸形患者30例,男性18例,女性12例;年龄8～ 60岁。病变部位:舌部10例,下唇8例,颊黏膜7例,软腭2例,面部3例。瘤体直径0.5～ 3.0cm。

瘤体略隆起,位置表浅,部分体位移动试验阳性。

2.方法　JC-BGCO2激光治疗仪,*大输出功率20W,激光波长10.6μm,光斑直径0.5～ 1.0mm。常规消毒,2%利多卡因局部浸润麻醉,以功率调为20W,激光沿瘤体边缘1mm切开皮肤或黏膜,有渗血者压迫止血,然后将激光功率调至5～ 10W,沿血管瘤边缘向中心进行逐层烧灼炭化。范围小的瘤体出血较少一般可一次完成治疗;稍大瘤体切开炭化组织过程中出血稍多,可压迫止血,然后对小血管可采用激光凝固止血,一般2～ 3次完成治疗,术中无需缝合。

结果

25例一次治愈,5例2～ 3次治愈,治愈率为100%。随访6个月无复发。

讨论

血管瘤及血管畸形过去统称为血管瘤,一般分为毛细血管瘤、海绵状血管瘤和蔓状血管瘤3种[1]。按新的分类,本组病例的静脉畸形应属于过去意义上的海绵状血管瘤[2],多在出生时发现,好发于口腔颌面部,常见于唇、舌、颊、龈、腭及面部皮肤。可采用手术、冷冻、硬化剂、激光、生物等方法治疗。治疗方法较多,各有其局限性,对于较大静脉畸形,治疗比较困难,可将联合上述方法治疗。

口腔颌面部静脉畸形目前比较有效和成熟的治疗方法是采用Nd∶YAG激光治疗,因为静脉畸形是由大量扩张的血管及衬有内皮细胞的无数血窦组成,血窦大小形状不一,如海绵状结构,其中充满大量红细胞,血红蛋白可大量吸收Nd∶YAG激光而产生凝固效应。通过Nd∶YAG激光照射,可使瘤体迅速缩小。近年来,我们尝试用CO2激光治疗口腔颌面部小范围表浅的静脉畸形也取得了较好的疗效。CO2激光功率密度高,光环属细光束,能量密度为1 000J/cm 2,故切

割组织损伤小,对创面小血管有止血作用,并能剌激修复再生过程,与常规手术治疗相比优越性显著。尤其是在面部遗留瘢痕不明显,满足了患者的审美要求。

在颌面部静脉畸形激光治疗中,CO2激光效果不如Nd∶YAG激光,适应证较窄,只适合范围较小的表浅瘤体,不适合直径大于3cm的瘤体。因为CO2激光属高能量激光,功率大时可使组织出现气化炭化效应,容易引起出血,操作时功率不应调至过大,这样能封闭小血管,减少出血,保持术野清楚,发现处理大的血管,炭化时移动速度不可过快。与Nd∶YAG激光相比,CO2激光术后反应小,容易控制切割深度,稳定性好,价格低廉,在无Nd∶YAG激光时,可替代手术治疗表浅小范围的口腔颌面部静脉畸形。

对于颌面部较小的静脉畸形,激光治疗成功率高,治愈率高;较大的畸形可采用激光配合其他方法治疗也可取得较好的治疗效果。

参　考　文　献

[ 1]邱蔚六.口腔颌面外科学[M].第4版.北京:人民卫生出版社,2001.258-259.

[ 2]赵福运.先天性血管瘤及脉管畸形的诊断和治疗[J].中华口腔医学杂志,2005,40:203-205.

(收稿日期:2005-03-22)

·345·

中国激光医学杂志2005年12月第14卷第6期　ChinJLaserMedSurg,December 2005,Vol 14,No.6